Шаперонин TRiC. Немного о механизме

Раз уж я взялась рассказывать про структуру этого шаперонина, стоит коснуться и вопроса о механизме его действия. Тем более что здесь есть о чем поведать. Поэтому заранее прошу прощения у всех за много буков в посте J

Не так уж много народу в мире изучает TRiC, и потому я опять буду цитировать статьи одного из титанов в этой области – группы под руководством Judith Frydman (США). За механизм шаперонина они взялись давно, еще в 2004 году придумали общую схему механизма действия TRiC, которая изображена на рисунке ниже.

Согласно этой схеме, цикл действия шаперонина состоит из следующих стадий:

1. Связывание с TRiC несвернутого субстрата и уход в раствор АДФ (сайт связывания которого находится в экваториальном домене каждой субъединицы TRiC).
2. Связывание АТФ экваториальными доменами шаперонина и, как следствие, переход белка в так называемое «полузакрытое состояние».

3. Частичный гидролиз АТФ, что приводит к полному закрытию полости TRiC и сворачиванию субстрата внутри полости.

4. Выход в раствор свернутого субстрата и неорганического фосфата. АДФ остается связанным с TRiC до момента связывания очередного субстрата.

Казалось бы, схема проста и понятна. Однако вопросов в статье все же больше, чем ответов. Так, например, неясным осталось

- как TRiC распознает свои субстраты, а точнее с помощью чего? На эту роль предлагались (1) α-спирали в дистальной области апикального домена, (2) подвижная α-спираль, выполняющая у TRiC роль крышки от полости, или (3) собственно внутренняя стенка полости, покрытая заряженными и полярными остатками.

- как именно связывание и гидролиз АТФ обеспечивают конформационные изменения в белке, что приводит к сворачиванию белков? Было известно, что изменения в структуре субъединиц происходят даже при связывании негидролизуемого аналога АТФ, но для сворачивания субстрата необходима еще стадия гидролиза.

- как конформационные изменения координируются между субъединицами кольца? И как связывается АТФ субъединицами – одновременно или последовательно?

- и, наконец, какова роль крышечки, которая у TRiC, в отличие от бактериальных шаперонинов, представлена дополнительными спиралями в составе апикальных доменов? Нужна ли она только для проталкивания субстрата внутрь полости или она имеет какие-то особенные функции?

Ответ на последний вопрос был найден раньше всех. Как выяснилось (Reissmann et al., 2007), наличие крышечки в составе TRiC необходимо для синхронизации конформационных изменений во всех субъединицах шаперонина при присоединении АТФ. Связывание и гидролиз АТФ субъединицами TRiC, как оказалось, происходит последовательно, по принципу положительной кооперативности (для справки – коэффициент Хилла для гидролиза АТФ в экспериментах составлял 1.9-2.0). И так же последовательно, по механизму аллостерической регуляции, происходят изменения конформации субъединиц внутри кольца.

Годом позже (Booth et al., 2008) на свет появились первые красивые картинки, схематично изображающие перемещения доменов внутри каждой субъединицы шаперонина, которые собственно и приводят к закрыванию полости TRiC. Тогда же стало ясно, что подобные движения доменов различаются у шаперонинов I и II группы. На схеме слева, рисунки a,b изображают вращения доменов у TRiC (II группа), а рисунки c,d – у его бактериального аналога GroEL (I группа). Подробнее о том, кто такой TRiC, можно прочитать тут.

Самое основное, принципиальное отличие шаперонинов I и II групп заключается в том, что апикальные домены каждой из субъединиц при закрывании полости у этих белков вращаются в разные стороны. У GroEL и других бактериальных шаперонинов – по часовой стрелке, а у TRiC и термосомы – против часовой стрелки (абсолютное значение угла поворота при этом практически одинаково). Конформационные изменения в промежуточных доменах при этом схожи, а вот изменения конформации экваториальных доменов в статье почти не рассматривались.

Под конец стоит упомянуть пару последних статей (Zhang et al., 2010 и Pereira et al., 2010) на тему механизма действия шаперонинов II группы. Объект изучения в этих статьях – уже не TRiC, а шаперонин архей вида Methanococcus maripaludis – сокращенно называемый Mm-cpn. Авторам удалось расшифровать структуры этого шаперонина, в открытом (без АТФ) и закрытом (с АТФ) состояниях, методами криоэлектронной микроскопии (в сочетании с компьютерным моделированием) и рентгеноструктурного анализа. Для справки: разрешение структуры в первом случае составляет 8 Å для структуры в открытом состоянии и 4.3 Å – в закрытом (что очень неплохо для микроскопии), а во втором случае – 6 Å для структуры в открытом состоянии (не слишком здорово в случае X-Ray, но для такой большой и сложной структуры – сойдет) и 3.5 Å для структуры закрытого шаперонина.

Mm-cpn представляет собой хорошую модель для изучения механизма работы шаперонинов II группы, поскольку, как и в случае TRiC, гидролиз АТФ его субъединицами происходит согласованно (благодаря все той же аллостерической регуляции), а структуры Mm-cpn и TRiC весьма похожи. Поэтому можно считать, что большинство деталей, касающихся действия Mm-cpn, верны также и для шаперонина TRiC. Правда следует отметить, что для исследования структуры в открытом состоянии авторы использовали «урезанную» форму Mm-cpn – без спиралей апикального домена, выполняющих роль крышечки. Сделано это было потому, что полноразмерные молекулы Mm-cpn в открытом состоянии «приклеиваются» к подложке этими спиралями, в результате чего все молекулы под микроскопом оказываются одинаково ориентированы. А при рентгеноструктурном анализе эти спирали все равно не видны – слишком велика их подвижность даже в закристаллизованной молекуле.

При анализе структур авторы уделили особое внимание взаимодействиям субъединиц друг с другом внутри одного кольца и взаимодействиям колец в составе полного комплекса. Выяснилось, что в закрытом состоянии все домены в составе субъединиц контактируют друг с другом, в то время как в открытом состоянии контакты сохраняются лишь в области экваториальных доменов. Внутри кольца субъединицы удерживаются в основном за счет гидрофобных взаимодействий, и эти же взаимодействия обеспечивают связь колец друг с другом, когда шаперонин находится в открытом состоянии. В закрытом же состоянии на первый план выступают солевые мостики между остатками экваториальных доменов субъединиц из разных колец. Вид комплекса в открытом и закрытом состояниях представлен на следующем рисунке.

Помимо этого авторы отметили, что при переходе Mm-cpn в закрытое состояние субъединицы шаперонина поворачиваются таким образом, что поверхность его полости оказывается выстлана в основном гидрофильными остатками. Аналогичное явление было ранее описано для GroEL (Xu et al., 1997). Такое изменение заряда внутренней поверхности шаперонина необходимо для сворачивания субстрата внутри полости. Однако, как именно это влияет на сворачивание белков, пока остается неясным.

И наконец – последнее важное наблюдение, сделанное авторами: субъединицы Mm-cpn (и, возможно, также субъединицы TRiC) при закрывании полости вращаются вокруг одной оси как единая твердая конструкция. Ось вращения располагается в районе остатка Pro41 в составе экваториального домена. Благодаря этому процесс закрывания-открывания полости шаперонина при взгляде сверху напоминает процесс открывания и закрывания зрачка человеческого глаза.

В дальнейшем авторы планируют разделить 2 кольца шаперонина и посмотреть, к каким эффектам это приведет. Что же касается собственно связывания и сворачивания субстратов шаперонином TRiC (вопрос, который был озвучен в начале этого рассказа) – это отдельная большая тема, достойная особого поста. Быть может, в скором времени я за него возьмусь...